Chromatographe en phase liquide couplée à la spectroscopie d’absorption UV-Vis (HPLC-DAD)

La chromatographie en phase liquide, dans sa configuration utilisée au LRMH, est un outil d’analyse moléculaire séparative.


Matériel utilisé

L’appareil utilisé est un système modulaire Agilent HP 1100 composé d’une pompe quaternaire, un passeur automatique, un thermostat pour les colonnes et un détecteur à barrette de diodes avec une gamme spectrale 190-950 nm. Une pompe binaire supplémentaire et utilisée dans le développement des méthodes. Les volumes extra-colonne (connectique et cellule de détecteur) ont été optimisés par nos soins pour le travail avec des colonnes de longueur 100 mm et de diamètre interne 2.1 mm. Le système fonctionne habituellement en conditions de phase inverse avec les phases stationnaires de granulométrie 3 µ et avec les élutions en gradient de modificateur organique.

Principe de fonctionnement

Elle permet d’analyser les mélanges complexes de molécules organiques solubles dans un solvant ou un mélange de solvants (phase mobile, éluant) et pompée sous pression (de l’ordre de 20-400 bar) à travers d’une colonne chromatographique rempli d’une phase stationnaire. Le rôle de la phase stationnaire est de retenir les composés véhiculés par percolation par la phase mobile. La rétention peut être basée sur les phénomènes d’interactions de natures différentes, mais avec des phases stationnaires hydrophobes (comme type C18) et éluant composé d’eau et d’un solvant organique (ex. acétonitrile, méthanol), le mécanisme de rétention est basé principalement sur les forces de dispersion. Elles s’exercent entre les composés d’un mélange et la phase stationnaire et leur force dépend de la hydrophobicité de chaque type de molécule, ce qui permet d’obtenir leur séparation. Ainsi les molécules moins hydrophobes sont élues plus rapidement de la colonne chromatographique alors que celles plus hydrophobes sont plus retenues. Toutefois, la composition de l’éluent est choisie de manière à assurer l’élution de tous les composés d’intérêt au cours d’une analyse. Quand les composants d’un mélange couvrent une large gamme de hydrophobicités, il est nécessaire d’appliquer un gradient ascendant en modificateur organique qui permet d’accélérer l’élution des composés plus hydrophobes.

Les composés sortant de la colonne chromatographique sont détectes par le détecteur, mais à condition d’absorber le rayonnement électromagnétique dans le domaine UV-Vis. Le détecteur, mis à part la détection à des longueurs d’onde prédéfinis, permet de tracer un spectre d’absorption complet de composés séparés. Les paramètres caractéristiques de chromatographie (temps de rétention d’un composé) combinés aux paramètres spectrales (allure de son spectre, maxima et minima d’absorption) sont utilisés pour caractériser un composé séparé par comparaison avec les mêmes paramètres obtenus avec les composés de référence.

Cette technique est utilisée au LRMH surtout pour analyse des colorants naturels et synthétiques dans les textiles et les peintures et polychromies, mais quelques autres applications (mycosporines, huiles essentielles) ont été développées pour les études microbiologiques. La miniaturisation d’approche analytique développée au LRMH permet de travailler avec de volumes d’injection de l’ordre de 5 µl de solution à analyser. Cela à permis de diminuer drastiquement la taille d’échantillon nécessaire pour analyse en comparaison avec des protocoles classiques.

Les analyses de composés sont effectuées de manière qualitative et comparative, mais la technique permet de réaliser des analyses quantitatives.